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  CHROMATOGRAPHIE

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  HPLC, GC

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Säulen-Chromatographie:
Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Gaschromatographie (GC)
Univ.Doz.Dr.med. Wolfgang Hübl
  
Zusammenfassung
  • Die Chromatographie gehört zu den Verfahren, bei denen Stoffgemische untersucht werden, indem man sie in ihre einzelnen Bestandteile auftrennt (Trenntechniken oder Separationsverfahren).
     
  • Basis der Auftrennung der Stoffe ist die unterschiedliche Verteilung der Stoffe in zwei Phasen. Die mobile Phase (Flüssigkeit oder Gas) bewegt sich an der stationären Phase (Feststoff oder Flüssigkeit) vorbei und nimmt die Stoffe dabei unterschiedlich schnell mit.
     
  • Bei der Säulen-Chromatographie befindet sich die stationäre Phase in einer Säule, durch die die mobile Phase fließt. Dazu gehören die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und die Gaschromatographie (GC).
     
  • Anwendungen in der Medizin: Analyse von Hämoglobinen, Aminosäuren, Porphyrinen, Hormonen, Vitaminen, Spurenelementen, Medikamenten, Drogen, Alkohol und anderen Giften in darauf spezialisierten Labors.
     
  
Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

HPLC steht für High Pressure Liquid Chromatography (manche sprechen auch von High Performance Liquid Chromatography). Die HPLC ist eine sehr leistungsfähige chromatographische Technik zur Auftrennung und Analyse von Stoffgemischen. Sie gehört zur Gruppe der Säulen-Chromatographien, die stationäre Phase ist in eine Stahlsäule gepackt ist. Flüssigkeiten bilden die mobile Phase.

Schema der Säulenchromatographie Das Prinzip ist nicht außergewöhnlich
Das Prinzip der Auftrennung bei der HPLC gleicht anderen Chromatographieverfahren: Die zu analysierende Probe (farbige Kugeln) wird von einer durch die Säule fließende Flüssigkeit (=die mobile Phase) mitgenommen.
Die einzelnen Bestandteile der Probe wandern aber ungleich schnell, weil sie durch Wechselwirkungen mit der stationären Phase (grau) unterschiedlich stark aufgehalten werden.

Beim Austritt aus der Säule kann man die einzelnen Stoffe mit einem geeigneten Detektor (D) nachweisen. Das ist aber auch nichts besonderes, das macht man bei der normalen Säulen-Chromatographie auch.

 

Was ist das Besondere an der HPLC?

Wie der Name sagt, ist das der hohe Druck, mit dem man die mobile Phase durch die Säule pumpt. Aber der Druck ist natürlich nicht Selbstzweck:

Das Problem: Will man bei der Säulen-Chromatographie eine gute Auftrennung, braucht man eine lange Säule und eine möglichst kleine Partikelgröße der stationären Phase. Aber diese Faktoren verlangsamen die Analyse beträchtlich. Man muss Kompromisse schließen, damit die Flüssigkeit rasch genug durch die Säule fließt. Sie wird ja nur von der Schwerkraft angetrieben. Die Trennleistung der normalen Säulen-Chromatographie war daher für viele Anwendungen nicht ausreichend.

Der Ausweg: man setzt Druck ein, um die Flüssigkeit durch die Säule zu pumpen. Dann kann man viel kleinere Partikel als stationäre Phase einsetzen, hat dadurch eine hervorragende Trennung und kann relativ kurze Säulen einsetzen. Außerdem läuft die Trennung schneller ab.

In Zahlen heißt das:

  • Normale Säulen-Chromatographie: Partikelgrößen meist von 100 - 300 µm Durchmesser, Säulenlänge von 0.5 - 3 m, Säulendurchmesser 0.5 - 5 cm.
  • HPLC: Partikelgrößen meist 3 - 10 µm, Säulenlänge 5 - 30 cm, Säulendurchmesser (innen) 2 - 4 mm.
     
    typische HPLC Säule Typische HPLC-Säule aus Stahl

Man braucht dazu allerdings relativ hohe Drücke. Zur Verwendung einer HPLC-Säule kann ein Druck von 100 - 200 bar notwendig werden.

 

UHPLC hat noch höhere Trennleistung

In Entwicklung sind HPLC-Systeme, die Säulen mit noch kleineren Partikeln verwenden (1 µm) und daher noch höhere Drücke (2000 bar und mehr!) einsetzen müssen: Ultrahigh-Pressure Liquid Chromatography (UHPLC).

 

Aufbau eines HPLC-Systems

Schema einer HPLC Einfacher als es aussieht
Vergessen wir vorerst die 2. Pumpe, das Mischventil MV und das Probenventil PV. Dann ist es ganz einfach: Pumpe 1 pumpt die mobile Phase (den Eluenten) durch die Säule. Der nimmt die verschiedenen Stoffe der Probe verschieden schnell mit. Beim Austritt werden die Stoffe gemessen.

Wie bringt man eine Probe in so ein Hochdrucksystem?
Man gibt sie in aller Ruhe mit einer Spritze in den oberen Kanal des Probenventils PV (schwarzer Pfeil) und schiebt das PV rasch nach unten (grüner Pfeil). Die Probe wird dann von der mobilen Phase zur Säule transportiert.
  
Vom Schema zur Realität:
Shimadzu-HPLC HPLC-Kompaktsystem
So sieht ein kompaktes HPLC-System aus.
Man erkennt aber nicht viel. Außer die Behälter für die Eluenten (=mobile Phase) links oben und den Auswerte-Computer rechts.
(Photo der Firma Shimadzu)

Neben den Kompaktsystemen kann man auch einzelne Module kaufen und zusammenstellen. 

Schimadzu 2-Kolbenpumpe zum Pumpen des Eluenten (= mobilen Phase) Pumpe eines Modulsystems
Die Pfeile zeigen auf das typische "Schlauchsystem" einer HPLC: Wegen des hohen Drucks müssen Stahlrohre verwendet werden (sind aber biegsam).
(Photo der Firma Shimadzu)

 

Wie sieht das Ergebnis einer HPLC aus?

Man misst mit dem Detektor (das könnte ein einfaches Photometer sein) kontinuierlich am Ende der Säule. Die Messwerte stellt man als Kurve dar und erhält dadurch das Chromatogramm. Die einzelnen Erhebungen nennt man Peaks.

Ergebnis einer HPLC-Trennung eines Zuckergemisches Trennung von Zuckern
So könnte ein kurzes Chromatogramm aussehen. Man sieht drei dominierende Peaks. In diesem Beispiel die Zucker Maltose, Rhamnose und Fucose. Woher man das weiß? Weil das keine echte Probe ist, sondern ein Gemisch aus diesen drei Zuckern. Woher man weiß, welcher welcher ist? Man analysiert die Zucker vorher einzeln.
Hat man das einmal ausgetestet, kann man Proben laufen lassen. Findet man dann einen Peak an der Stelle, an der normalerweise Stoff X kommt, dann kann es sich auch in der Probe um diesen Stoff X handeln.
Natürlich nur, wenn kein anderer Stoff dabei stört und "darunter liegt". Das muss man vorher durch geeignete Trennungsbedingungen, durch Wahl des passenden Detektors und vielleicht auch durch spezielle Vor- oder Nachbehandlung der Probe sicherstellen.

Die Zahlen oberhalb der Peaks sind die sog. Retentionszeiten (in Minuten). Das ist die Zeit vom Start der Analyse bis zur Detektion des Peaks. Und die sind wichtig: denn jetzt weiß man, wann welcher Stoff kommen sollte. Und das sollte bei gleichbleibenden Bedingungen (und für diese muss man sorgen) gleich bleiben. Man muss einen Stoff an der Retentionszeit erkennen, ein Peak schaut ja wie der andere aus.

Die Fläche unter den Peaks ist proportional der Konzentration des Stoffs. Die HPLC liefert dadurch sehr präzise quantitative Ergebnisse.

 

Wozu ist jetzt die 2. Pumpe gut?

Kommen wir auf die Abbildung zurück. Da war eine 2. Pumpe und ein Mischventil eingezeichnet. Zur Erklärung, warum man dies braucht, hilft folgende Animation.

Animiertes Schema einer Säulenchromatographie Die blauen Kugeln brauchen zu lange
Beachten wir nur die Wanderungsgeschwindigkeit der verschiedenen Stoffe. Die roten Kugeln laufen sehr schnell und kommen bald aus der Säule. Die grünen schon langsamer. Und die blauen wandern extrem langsam.

 

Das ist aus verschiedenen Gründen unbefriedigend:

  • Es dauert zu lange bis man die blauen messen kann.
     
  • Es ist auch nicht gut, wenn Stoffe zu lange in der Säule wandern. Die Peaks werden dann breiter und ein Peak könnte mit einem Nachbarpeak verschmelzen. D.h., die Trennung wird schlechter.

1. Lösungsansatz: Man nimmt eine mobile Phase, die die Stoffe schneller aus der Säule wäscht. Das ist nicht schwer. Die blauen Kugeln werden dann schneller kommen und schönere Peaks machen. Aber die ersten Stoffe werden vielleicht zu schnell kommen. Die roten und die grünen Kugeln könnten gleichzeitig kommen. Will man alle Stoffe analysieren, ist das daher keine gute Lösung. Will man nur die blauen, könnte man das so machen.

Besserer Lösungsansatz: Man nimmt 2 oder mehrere mobile Phasen (=Eluenten). Man setzt zuerst einmal die "milde" mobile Phase ein, wartet bis die roten und die grünen Kugeln aus der Säule sind. Dann erst nimmt man die "scharfe" mobile Phase und erreicht so, dass auch die blauen Kugeln rasch und mit einem halbwegs schlanken Peak aus der Säule kommen.

So erklären sich die 2 eingezeichneten Pumpen, Eluenten und das Mischventil. In der Praxis wechselt man meist nicht plötzlich von Eluent 1 auf Eluent 2 sondern die Pumpen oder das Mischventil werden so programmiert, dass dem Eluenten 1 immer mehr Eluent 2 beigemischt wird. Man mischt also kontinuierlich oder in Stufen immer mehr Eluent 2 (und ev. Eluent 3) dazu. Dies nennt man Gradient oder auch Gradiententrennung. Für viele Anwendung ist eine solche Gradiententrennung  notwendig.
Für einfachere Aufgaben braucht man dies nicht. Dann genügt ein Eluent. Dies nennt man isokratische Trennung.

 

Säulen

Säulen in der HPLC besitzen normalerweise einen Stahlmantel und sind mit einem Material mit sehr niedriger Teilchengröße (3 - 10 µm) befüllt. Manchmal dient die ursprüngliche Teilchenoberfläche als stationäre Phase. Oft werden die Teilchen chemisch mit einer Schicht überzogen, die dann die stationäre Phase bildet. Je nach gewünschter Anwendung bindet die Oberfläche der Partikel eher wasserlösliche Substanzen, wasserunlösliche Substanzen oder dient als Ionen-Austauscher. Es gibt eine Unzahl von verschiedenen Materialien für die unterschiedlichsten Anwendungen.
Reversed-Phase (RP) Chromatographie: Erwähnt soll noch der Ausdruck "RP-Säule" werden: Normalerweise trägt die Oberfläche des Füllmaterials (=stationäre Phase) polare* Gruppen. Und als Eluent verwendet man apolare (oder wenig polare) Flüssigkeiten.
Das kann man umdrehen: Man kann die Oberfläche der stationären Phase mit langen Kohlenstoffketten überziehen. Dann wird sie apolar und man nimmt eher polare Flüssigkeiten als mobile Phase. Die Phasen sind umgedreht (reversed). Daher der Ausdruck "Reversed-Phase" oder Reversed-Phase Säule, kurz RP-Säule.
*Die Erklärung der Begriffe polar/apolar würde zu tief in die Chemie bzw. Physik führen. Keine Erklärung aber praktisch wichtig: Polare Stoffe lösen sich gut in polaren Flüssigkeiten (z.B. Wasser), apolare in apolaren (z.B. Benzin, Hexan)

 

Vorsäulen (Guard-Columns = Schutzsäulen) erhöhen die Lebensdauer der Säule

Verunreinigungen in der Probe können die Lebensdauer eine Säule beträchtlich verkürzen. Billigere Säulen tauscht man einfach regelmäßg aus. Bei teureren kann man vor die eigentliche Säule eine billige, kurze Vorsäule schalten. Sie enthält das gleiche oder ein ähnliches Packungsmaterial wie die Hauptsäule und fängt so die Verunreinigungen der Probe ab. Man muss sie aber regelmäßig tauschen.

 

Detektoren

Der Detektor wird nach der Säule angebracht und beobachtet die austretende mobile Phase, in der die Stoffe einer nach dem anderen herauskommen.

  • Der Detektor kann wie ein Photometer arbeiten und die Abschwächung eines Lichtstrahls detektieren (im sichtbaren oder im UV Bereich): UV/Visible-Detektor.
     
  • Fluoreszenzdetektoren messen die durch einen Anregungsstrahl ausgelöste Fluoreszenz, um fluoreszierende Stoffe zu erkennen.
     
  • Man kann aber auch Änderungen der Lichtbrechung detektieren: Brechungsindex-Detektor (Refractive-Index bzw. RI-Detektor).
     
  • Elektrochemische Detektoren (ECD) detektieren Änderungen des Stromflusses zwischen zwei Polen, der durch die austretenden Stoffe verursacht wird.
     
  • Dioden-Array Detektoren
    Man kann eine Substanz mit einem UV/Visible-Detektor, also mit einer Art Photometer, bei einer bestimmte Wellenlänge detektieren. Man kann es aber auch bei 2 Wellenlängen machen. Man erhält so zusätzliche Information. Noch mehr Information erhält man, wenn man bei sehr vielen Wellenlängen misst. Man bekommt dann zu jedem Peak eine Art Spektralkurve. Das hilft, Substanzen und Störsubstanzen zu erkennen, denn man kennt das Spektrum der Substanz, die man erwartet. Ist das plötzlich verändert, könnte eine andere Substanz darunter liegen.
     
    Dioden-array: Die grau eingezeichneten Photodioden messen gleichzeitig viele Wellenlängen. Funktionsweise: Der Lichtstrahl tritt durch die mobile Phase und durch die darin gelösten Stoffe, wird von einem Gitter oder einem Prisma in seine Spektralfarben zerlegt und trifft dann auf eine Reihe von lichtempfindlichen Dioden, den Dioden-Array.

 

Post-Column-Derivatisierung (NACHsäulenderivatisierung)

Nicht alle Stoffe kann man in einem Detektor auf einfache Weise nachweisen. Manche muss man dazu erst mit einem anderen Stoff reagieren lassen. Das tut man, indem man der mobilen Phase, nachdem sie aus der Säule ausgetreten ist, z.B. einen Farbstoff beimischt. Erst dann geht es weiter zum Detektor.
Das klassische Beispiel ist die Post-Column-Färbung von Aminosäuren mit Ninhydrin.

 

Pre-Column-Derivatisierung (VORsäulenderivatisierung)

Bei der Post-Column-Derivatisierung werden die Substanzen nach der Auftrennung, also nachdem sie die Säule verlassen haben, verändert (z.B. gefärbt). Das ist ein nicht geringer apparativer Aufwand. Man braucht eine eigene Pumpe, ein T-Stück zum Mischen von mobiler Phase und Farbstoff. Das ganze muss eventuell auch in einigen Spiralenwindungen durch einen Ofen fließen, damit die Reaktion stattfindet.
In manchen Fällen kann man die interessierenden Stoffe schon vor der Trennung färben. Alle auf einmal im Probenfläschen. Erst dann wird die Probe analysiert. Man nennt dies Pre-Column-Derivatisierung.
Ein Beispiel wäre die Orthophthal-Aldehyd (=OPA)-Methode zur Aminosäurenbestimmung. OPA ist ein fluoreszierender Farbstoff. Diesen koppelt man vor der Auftrennung an die Aminosäuren. Man kann sie dann nach der Auftrennung mit einem Fluoreszenzdetektor nachweisen.

 

Externer und interner Standard

Es wurde schon erwähnt: Die Fläche unter dem Peak ist proportional zur Konzentration. Aber wie erhält man wirklich quantitative Ergebnisse, wie berechnet man die Konzentration einer Substanz?

Da gibt es 2 prinzipielle Möglichkeiten.

  • Der externe Standard
    Man stellt eine Lösung mit einer bestimmten Konzentration des interessierenden Stoffs her. Diese Standard-Lösung lässt man laufen. Man wird einen Peak erhalten und ein bestimmtes Verhältnis zwischen Peakfläche und Konzentration errechnen können. Diesen Faktor verwendet man für die Peaks in den zu messenden Proben.
    Das funktioniert aber nur unter gewissen Voraussetzungen: Man muss immer exakt die gleiche Probenmenge aufgeben. Die Bedingungen z.B. bei Derivatisierungen müssen immer exakt gleich bleiben. Und auch alle anderen Bedingungen sollten sich nicht ändern, sie könnten sonst das Ergebnis beeinflussen.
    Man kann mit externem Standard arbeiten, es funktioniert. Aber es gibt eine sicherere Methode.
       
  • Der interne Standard
    Dabei gibt man zu der zu analysierenden Probe eine bekannte, den zu messenden Substanzen ähnliche Substanz hinzu. Natürlich eine bestimmte Menge. Diese Substanz dient als interner Standard, sie ist in der Probe. Ab dem Zeitpunkt der Zugabe bis zur Messung macht der interne Standard alles mit, was auch die zu messenden Substanzen mitmachen. Man wertet den internen Standard (der ein schöner, gut getrennter Peak sein sollte) gemeinsam mit den anderen aus und berechnet die Konzentrationen der zu messenden Substanzen in Relation zum internen Standard.
    Vorteile: Hat man versehentlich etwas weniger Probe aufgegeben oder ist einmal die Post-Column-Färbung etwas schwächer ausgefallen. Kein Problem, auch der interne Standard wird ein kleinerer Peak werden. Im Verhältnis wird es passen und die Ergebnisse werden korrekt sein. Arbeitet man mit automatischen Probengebern über Nacht, in denen die letzten Proben vielleicht 16h nach den ersten gemessen werden, dann könnten diese durch Verdunstung konzentriert worden sein. Macht nichts, auch der interne Standard wird konzentrierter sein. All diese Probleme würden bei Einsatz eines externen Standards zu Fehlern führen.

 

Anwendungen in der Medizin

Im Routinelabor eher selten eingesetzt, eventuell zur Bestimmung des HbA1C. In etwas spezialisierteren Labors analysiert man damit Hämoglobine (bei Verdacht auf erbliche Hämoglobin-Fehlbildungen wie z.B. Thalassämie), Aminosäuren (Vd.a. Stoffwechselkrankheiten), Vitamine, Medikamente, Drogen, Catecholamine und deren Metaboliten (Blutdruckprobleme), andere Hormone, Hydroxyindolessigsäure (Vd.a. Karzinoidsyndrom),  Porphyrine (Vd.a. Porphyrinurie).

 


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Gaschromatographie (GC)

Die Gaschromatographie ist eine Methode zur Auftrennung und Analyse von Stoffgemischen. Wie bei anderen chromatographischen Verfahren ist die Basis der Auftrennung die unterschiedliche Verteilung der Stoffe zwischen einer stationären und einer mobilen Phase. Während sich die mobilen Phase an der stationären Phase vorbei bewegt, nimmt sie die Stoffe mehr oder weniger schnell mit. Stoffe, die sich stark an die stationäre Phase binden, werden langsam mitwandern, solche die mehr Affinität zur mobilen Phase haben, werden schneller mitwandern.

Mobile Phase
Das Besondere an der Gaschromatographie ist, dass die mobile Phase ein Gas und keine Flüssigkeit ist. Daher müssen die zu analysierenden Stoffe verdampfbar sein oder in verdampfbare Verbindungen überführbar sein.

Stationäre Phase
Die stationäre Phase (Flüssigkeiten oder Festsubstanzen) der GC befindet sich in einer relativ langen, spiralig angeordneten Säule. Diese ist entweder mit der stationären Phase bepackt oder ihre Innenwand wird von der stationären Phase ausgekleidet.

 

Aufbau eines Gaschromatographen

Schema eines Gaschromatographen Mit der Spritze bringt man die Probe in den Injektor. Dort wird sie unter Wärmeeinfluss verdampft. Der Gasstrom aus der Trägergasflasche nimmt die Probe zur Säule mit. In der Säule werden die Stoffe aufgetrennt: manche wandern schneller, manche langsamer durch die Säule.
Der Detektor zeichnet das Austreten der Stoffe auf.
Ergänzung: man kann flüssige Proben auch direkt auf die Säule aufgeben. Die Probe verdampft dann in der Säule.

Ein GC System in der Realität

Shimadzu Gaschromatograph Gaschromatograph
Bei diesem Kompaktsystem kann man die einzelnen Bausteine kaum erkennen. Die Tastatur zur Steuerung sieht man unten links.  Der Regler für die Kontrolle der Gasströmungen fällt rechts oben auf.
Dieser GC braucht nicht viel Platz. Dazu kommt aber noch mindestens eine Gasflasche.
(Photo: Fa. Shimadzu)

 

Wie sieht das Ergebnis einer GC aus?

Man misst mit dem Detektor kontinuierlich am Ende der Säule. Die Messwerte stellt man als Kurve dar und erhält dadurch das Chromatogramm. Die einzelnen Erhebungen nennt man Peaks.

Gaschromatographische Trennung eines Gemisches von Medikamenten Trennung von Medikamenten
Gaschromatographische Trennung von Medikamenten (Ethosuximid und verschiedene Baribituraten). Wie bei der HPLC ist die Zeit, die eine Substanz braucht, bis sie aus der Säule kommt, wichtig. Anhand dieser Zeit kann man erkennen, um welche Substanz es sich handelt.
Und wie bei der HPLC klärt man vorher durch Analyse von Einzelstandards, wann welche Substanz kommt.

 

Säulen

Man unterscheidet vor allem 2 Arten von Säulen

  • Gepackte Säulen (Packed Columns)
    Gepackte Säulen sind Glas oder Stahlrohre (innerer Durchmesser meist 1-5 mm), in die die stationäre Phase (Pulver kleiner Teilchen von 100-300 µm) gepackt wurde. Diese Säulen können einige Meter lang sein (werden zur Spirale geformt).
    Vorteil: verträgt größere Probenmengen. Nachteil: geringe Trennleistung.

    Trennmechanismus

    Die Teilchen in der Säule (z.B. Aluminiumoxidpulver) kann man als solche zur Trennung verwenden. Man nennt das auch GSC, Gas-Solid-Chromatography (übersetzt: Gas-Feststoff-Chromatographie). Dann basiert die Trennung vorwiegend auf Adsorptionsvorgängen. Oder man überzieht die Teilchen mit einer Flüssigkeit. Das nennt man GLC, Gas-Liquid-Chromatography (übersetzt: Gas-Flüssigkeits-Chromatographie). Dann liegen der Trennung vor allem Verteilungsvorgänge zu Grunde.

     
  • Kapillarsäulen (Capillary Columns)
     
    Kapillarsäule der Fa. Kemomed Kapillarsäulen sind dünne Kapillaren aus Glas-ähnlichem Material. Der innere Durchmesser ist nur 0.1-0.5 mm. Die Länge liegt meist zwischen 10 und 150 m.
    (Photo: Fa. Kemomed)

    In Kapillarsäulen wird keine stationäre Phase gepackt, sie bilden eine sehr dünne Röhre, eine Kapillare. Wo ist die stationäre Phase? Die kleidet die Wand der Kapillare aus. Meist ist dies eine Flüssigkeit, die an der Innenwand einen Film bildet. Die Säulen gibt es fertig mit Flüssigkeitsauskleidung zu kaufen. 
    Bei Flüssigkeit darf man sich nichts Wasser-ähnliches vorstellen. Die Flüssigkeiten bei der GC sind dickflüssig und schwer verdunstend. Verwendet werden z.B. Silikonpolymere oder Silikonpolyester.
    Kapillarsäulen zeigen eine hervorragende Trennleistung. Nachteil: es dürfen nur sehr kleine Probenmengen auf die Säule aufgegeben werden.

    Trennmechanismus
    Bei Kapillarsäulen mit Flüssigkeitsauskleidung erfolgt die Trennung der Stoffe durch Verteilungsvorgänge zwischen einem Gas und einer Flüssigkeit (GLC, Gas-Liquid-Chromatography).

    Es gibt noch andere Typen von Kapillarsäulen, diese werden aber seltener eingesetzt.

 

Mobile Phasen (Gase)

Als mobile Phase eignen sich z.B. Stickstoff, Helium oder Argon. Sie müssen von großer Reinheit sein, da Verunreinigungen die Säule schädigen können.
Der Gasfluss hängt von der Säule ab. Während gepackte Säulen eine Flussrate von 10 bis 60 ml/min brauchen, fließen durch Kapillarsäulen nur etwa 1 - 2 ml/min. Der Gasfluss muss genau kontrolliert* sein, er ist für die Trennung sehr wichtig.
*Im einfachsten Fall muss der Fluss immer konstant gehalten werden. Für speziellere Anwendungen (z.B. programmierte Änderungen der Säulentemperatur während der Trennung) darf er sich auch während Analyse ändern, aber immer unter kontrollierten, gleichbleibenden Bedingungen (2 Methoden: man hält den Druck konstant oder den Fluss).

 

Injektor (Probengeber)

Für die meisten Anwendungen werden die Proben in Lösungsmitteln gelöst und dann mit einer Spritze in das Gerät aufgegeben. Mit speziellen Spritzen oder speziellen Probengebern kann man auch Gase aufgeben.
Es gibt einige Methoden zur Probenaufgabe. Zwei prinzipiell unterschiedliche seien herausgegriffen:

  • Herkömmliche Methode
    Man sticht mit der probengefüllten Spritze durch eine hitzebeständige Membran und bringt die Probe in einen beheizten Bereich des Injektors ein (und in den Trägergasstrom). Die Probe verdampft durch die Hitzeeinwirkung und wird vom Trägergas in die Säule getragen.
     
  • On-Column-Methode ("Auf-Säulen"-Methode)
    Die dünne Nadel der Spritze wird bis zur Säule geführt. Die Probe wird (noch in flüssiger Form) in die Säule aufgegeben. Die Verdampfung findet in der Säule statt. Diese Art der Probenaufgabe hat stark an Bedeutung und Verbreitung gewonnen.

 

Der Säulenofen

Bei der HPLC braucht man ihn nicht für alle Anwendungen, bei der GC ist er von größter Wichtigkeit: der Säulenofen. Die Temperatur der Säule muss bei der GC genauestens eingehalten werden. Sie hat großen Einfluss auf die Trennung und die Ergebnisse. Auch setzt man häufig Temperaturprogramme ein. Darunter versteht man programmierte Änderung der Säulentemperatur während der Analyse.

 

Detektoren

Es gibt eine Vielzahl von Detektoren für die GC, weiter verbreitet sind:

  • Wärmeleitungsdetektor (TCD, Thermal Conductance Detector)
    Die Wärmeleitfähigkeit des aus der Säule austretenden Trägergases ändert sich durch die Beimengung der austretenden Stoffe. Das kann mit geeigneten Apparaturen gemessen werden.
     
  • Flammen-Ionisationsdetektor (FID)
    Die aus der Säule kommende Stoffe werden mit Wasserstoff und Luft vermischt und verbrannt. Dabei entstehen geladene Teilchen (Ionen) die mit einer Elektrode (also "elektrisch") gemessen werden.
    Die Ionen erhöhen die Leitfähigkeit der Flamme. Der Strom nimmt zu.
     
  • Flammenphotometrischer Detektor (FPD)
    Die aus der Säule kommenden Stoffe werden mit Wasserstoff und Luft verbrannt. Dabei senden Phosphor- oder Schwefel-haltige Verbindungen Licht ganz bestimmter Wellenlänge aus. Dieses Licht kann man messen.
     
  • Electron Capture Detektor (ECD, Elektronenen-Einfang)
    Durch die Wirkung eines radioaktiven Stoffs entstehen im Trägergas Elektronen, die einen Stromfluss zwischen zwei Elektroden ermöglichen, den man messen kann. Kommen Stoffe aus der Säule, die diese Elektronen einfangen, nimmt der Stromfluss ab.
    Funktioniert nur für Stoffe, die Elektronen einfangen können oder die man chemisch so verändern kann, dass sie dies tun.
     

 

Quantitative Auswertung nach der Peakfläche

Wie bei der HPLC ist auch bei der GC die Fläche des Peaks proportional zur Stoffmenge. Über externen und internen Standard siehe entsprechenden Absatz bei der HPLC.

 

Die GC-MS (GC-Massenspektrometrie) erlaubt eine eindeutige Identifizierung von Stoffen

In der GC entstehen aus dem Stoffgemisch einzelne Stoffe bzw. Peaks. Um diese näher zu untersuchen, wird jeder Stoff bzw. Peak in der sog. Massenspektrometrie weiter analysiert. Das Ergebnis ist ein Massenspektrogramm. Während Peaks alle ziemlich gleich aussehen, ist das  Massenspektrogramm jedes Stoffs charakteristisch. Dadurch lassen sich Stoffe meist eindeutig definieren.
Alle Peaks eines GC-Chromatogramms sehen ziemlich gleich aus. Nur die Retentionszeit des Peaks, also die Zeitspanne zwischen Aufgabe der Probe und Detektion des Peaks, sagt uns, um welchen Stoff es sich handelt. Oder besser: handeln könnte. Es ist nie 100%ig auszuschließen, dass ein anderer Stoff, mit dem man nicht gerechnet hat, an derselben Stelle im Chromatogramm auftaucht. Hat das Ergebnis rechtliche Konsequenzen (Drogennachweis), kann eine GC-Analyse allein zu wenig sein. Eine anderes Problem sind Peaks, die man überhaupt nicht zuordnen kann.
Um einen Peak in der GC näher zu untersuchen kann man ein Massenspektrometer anschließen. Das wird gleich ans Ende des GC, also nach der Säule angeschlossen. Das Massenspektrometer zerlegt den Stoff in viele verschiedene geladene Teilchen (Ionen) und analysiert die entstandenen Teilchen. Genauer gesagt, misst es das Masse/Ladungs-Verhältnis aller entstandenen Teilchen. Und für viele Stoffe gibt es da ein bestimmtes Muster, an dem man sie erkennen kann.

 

Anwendungen in der Medizin

Einsatzmöglichkeiten in der klinischen Diagnostik:

  • Hormonbestimmungen
  • Vitamine
  • Manche Spurenelemente
  • Medikamente
  • Drogen
  • Alkohol
  • andere Gifte

 


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Gas-Chromatographie, HP-LC, Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie
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Letzte Änderung 2005-01-16

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