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  CHROMATOGRAPHIE

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  PC, DC (TLC)

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Planare Chromatographie
:
Papier- und Dünnschichtchromatographie

Univ.Doz.Dr.med. Wolfgang Hübl
  
Zusammenfassung
  • Die Chromatographie gehört zu den Verfahren, bei denen Stoffgemische untersucht werden, indem man sie in ihre einzelnen Bestandteile auftrennt (Trenntechniken oder Separationsverfahren).
  • Basis der Auftrennung der Stoffe ist die unterschiedliche Verteilung der Stoffe in zwei Phasen. Die mobile Phase (Flüssigkeit oder Gas) bewegt sich an der stationären Phase (Feststoff oder Flüssigkeit) vorbei und nimmt die Stoffe dabei unterschiedlich schnell mit.
     
  • Bei der planaren Chromatographie (Flachbett-Chromatographie) läuft die Trennung auf Papier oder einer beschichteten Glasplatte ab (Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie).
     
  • Im medizinischen Labor werden planare chromatographische Techniken kaum noch eingesetzt.
 

 

Papierchromatographie

Wegen ihrer Einfachheit war die Papierchromatographie eine weit verbreitete Technik zur Analyse von Stoffgemischen. Für die medizinische Labordiagnostik hat sie nur mehr historische Bedeutung.

Schema des Ablaufs einer Papierchromatographie Schema des Ablaufs einer absteigenden Papierchromatographie

1. Auf einem Papier wird das Probengemisch aufgetragen. Dann wird das Ende des Papierstreifens in eine Wanne gehängt, in der sich die mobile Phase (eine Flüssigkeit) befindet.

2. Die mobile Phase wandert durch Kapillarwirkung und Schwerkraft den Papierstreifen entlang. Die einzelnen Stoffe der Probe nimmt sie dabei verschieden weit mit.

Nach der Trennung entnimmt man das Papier und trocknet es.

 

Ergänzungen zur Abbildung: Es wäre schlecht, wenn die mobile Phase vom Papier weg verdunstet. Damit das nicht passiert, lässt man die Papierchromatographie in einem geschlossenen Behälter ablaufen, in den etwas mobile Phase eingefüllt wird, die den Boden bedeckt. Die Luft ist dann mit der mobilen Phase gesättigt. Während die Chromatographie läuft, hängt die links oben dargestellte Anordnung in diesem Behälter (ohne den Boden zu berühren).
Es gibt auch eine aufsteigende Papierchromatographie. Die ist apparativ ein wenig einfacher. Man füllt in einen Behälter wenige Zentimeter hoch mobile Phase und hängt das Papier so hinein, dass es in diese eintaucht. Der Nachteil ist, dass die Trennung gegen die Schwerkraft erfolgt und die Laufstrecke maximal etwa 30 cm lang wird. Länger Laufstrecken bedeuten aber höher auflösende Trennungen.

 

Auf welchem Prinzip beruht die Trennung bei der Papierchromatographie?

  • Stationäre Phase
    Die stationäre Phase bildet der Wassermantel, der die Zellulosefasern umgibt.
    Zellulose ("Papier") im Mikroskop
     
    Zellulose, hat verschiedene Eigenschaften, die es als Trägermaterial für die Chromatographie geeignet machen:
    • Die einzelnen Zellulosefasern bilden ein Geflecht, das durchlässig ist und eine große Oberfläche bietet.
        
    • Zellulose hat die Eigenschaft Wasser anzuziehen. Die Zellulosefasern sind daher von einem Wassermantel umgeben. 
  • Mobile Phase
    Als mobile Phase eignen sich organische Lösungsmittelflüssigkeiten, z.B. Butanol oder Phenol.
    (Diesen muss Wasser beigemischt werden, damit sie beim Durchwandern des Papiers diesem nicht seinen Wassermantel entziehen).
  • Der Trennungsmechanismus
    Die Trennung beruht bei der Papierchromatographie vorwiegend auf einer Verteilungs-Chromatographie. Die Stoffe verteilen sich zwischen der wässrigen stationären Phase und der Flüssigkeit der mobilen Phase. Stoffe, die sich gut in Wasser lösen, bleiben länger in der stationären Phase und werden nur langsam wandern. Stoffe die besser in der mobilen Phase löslich sind wandern schnell.

 

Wie macht man das Ergebnis sichtbar?

Trennt man Farbstoffe, ist es leicht. Sie bilden farbige Flecken. Ungefärbte Stoffe, die fluoreszieren, kann man im UV-Licht sichtbar machen. Radioaktive Stoffe können eine Photoplatte schwärzen. Andere Stoffe muss man mit einem aufzusprühenden Nachweisreagenz einfärben.

 

Woher weiß man welcher "Fleck" welcher Substanz entspricht?

Das ist tatsächlich nicht immer so einfach. Prinzipiell erkennt man Substanzen (=Stoffe) in der Chromatographie daran, wie schnell sie laufen. Also bei der Papierchromatographie an der Strecke, die sie zurückgelegt haben. Und zwar am einfachsten im Vergleich zur Front der mobilen Phase.

Rf-Wert: Wie weit läuft ein Stoff im Vergleich zur Lösungsmittelfront Berechnung des Rf-Wertes
Dividiert man die Laufstrecke der Substanz (a) durch die der mobilen Phase (b), erhält man den sog. Rf-Wert.
Dieser Wert (er liegt zwischen 0 und 1) ist für jeden Stoff bei gleichbleibenden Bedingungen charakteristisch. Er dient daher der Erkennung der Stoffe. Leider können verschiedene Stoffe gleiche Rf-Werte haben.
Die Abkürzung Rf wird mit "relate to front" aber auch mit "ratio front" erklärt.

 

Als Alternative oder als zusätzliche Maßnahme kann man auch eine bekannte Substanz als Standard mitlaufen lassen:

RST-Wert: Wie weit läuft ein Stoff im Vergleich zu einem Standard Parallele Analyse einer Standardsubstanz
Man trägt neben der Probe eine bekannte Substanz auf, die als Referenz-Standard dient (R). Die fragliche Substanz (?) hat die gleiche Wanderungsstrecke und könnte mit dem Standard ident sein.
Außerdem kann man für jeden Fleck die sog. RST-Werte berechnen. Der RST-Wert ist die Laufstrecke einer Substanz der Probe dividiert durch die Laufstrecke des Standards. Auch dieser Wert kann helfen zu erkennen, welche Substanz den Fleck auf dem Papier verursacht hat.

Die Abkürzung RST wird mit "relative to standard" aber auch mit "ratio standard"   erklärt.

 

Wie kann man die Stoffe quantifizieren (die Menge bestimmen)?

Ein Anhaltspunkt für die Menge ist die Größe des Flecks. Man hat früher mit Millimeterpapier die Fläche abgemessen und daraus die Menge berechnet (sie ist proportional zum Logarithmus der Fläche). Man hat Flecken auch ausgeschnitten um die Menge des Stoffs zu bestimmen.
Heute kann man das Ergebnis mit dem Computer einscannen und die Fläche und Konzentration berechnen lassen.
Das sind aber alles keine idealen Methoden und das ist auch einer der Nachteile der planaren Chromatographien (Papier- und Dünnschichtchromatographie): Man kann die Menge der aufgetrennten Stoffe nur sehr schwer und nur ungenau bestimmen.

 

Zweidimensionale Papierchromatographie

Wenn man eine "fertige" Papierchromatographie um 90° dreht und in eine andere mobile Phase taucht, kann man die Stoffe ein 2. Mal auftrennen. Flecken, die nach der ersten Trennung einheitlich schienen, können sich nach der zweiten Trennung in zwei oder mehrere Flecken aufteilen. Das weist darauf hin, dass der ursprüngliche Fleck von mehr als einem Stoff verursacht wurde.

 

Anwendungen der Papierchromatographie

Wie erwähnt, wird die Papierchromatographie heute kaum noch eingesetzt, Früher verwendete man sie u.a. zum Nachweis von Aminosäuren im Harn, Nachweis von Medikamenten und zur Identifikation von Zuckern.

 


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Dünnschichtchromatographie

Die Dünnschichtchromatographie ist ein Verfahren zur Auftrennung und Analyse von Stoffgemischen. Sie gehört wie die Papierchromatographie zu den planaren Chromatographien (Flachbett-Chromatographien). Die beiden Methoden haben sehr viel gemeinsam und ein großer Teil des für die Papierchromatographie Gesagten gilt auch für die Dünnschichtchromatographie. Die nachfolgenden Informationen beschränken sich daher auf das Wesentlichste und auf die Unterschiede zwischen den beiden Methoden.

Schema des Ablaufs einer Papierchromatographie. (Aufsteigende) Dünnschichtchromatographie
Die Dünnschichtplatte wird in die mobile Phase getaucht. Die mobile Phase steigt hoch. Stoffe werden getrennt, weil sie von der mobilen Phase verschieden weit mitgenommen werden.
Ergänzung zur Abbildung: Auch die Dünnschichtchromatographie muss in einer Entwicklungskammer laufen, also in einem verschlossenen Behälter. So ist die Luft mit mobiler Phase gesättigt und diese verdunstet nicht von der Dünnschichtplatte weg.

 

 

Auf welchem Prinzip beruht die Trennung bei der Dünnschichtchromatographie?

  • Stationäre Phase
    Die stationäre Phase wird von einer dünnen Schicht einer stark adsorbierenden Substanz gebildet. In der ursprünglichen Form wurde diese Schicht auf eine Glasplatte aufgebracht.
    Die vorwiegend verwendeten Adsorbentien sind Siliziumoxide (Kieselgur, Kieselgel), Magnesiumsilicat, Magnesiumoxid und Aluminiumoxid.
    Prinzip der Herstellung: Man verrührt die Adsorbentien mit destilliertem Wasser zu einem Brei, trägt diesen gleichmäßig auf die Platte auf und lässt sie Hitze-trocknen. Heute werden aber nur fertige Produkte verwendet.
     
  • Mobile Phase
    Als mobile Phase eignen sich organische Flüssigkeiten (z.B. Petrolether, Isopropanol, Butanol o.Ä.).
  • Der Trennungsmechanismus
    Die Trennung beruht bei der Dünnschichtchromatographie vorwiegend auf Adsorptionsphänomenen. Die Stoffe verteilen sich zwischen der Oberfläche der stationären Phase und der Flüssigkeit (mobilen Phase).
    Für die Wanderungsgeschwindigkeit (bzw. Laufstrecke) entscheidend ist:
     
    • Wie stark bindet sich der Stoff an die stationäre Phase, an das Adsorbens.
       
    • Wie gut ist der Stoff in der mobilen Phase löslich.
       
      Stoffe, die stark an die stationäre Phase binden und/oder schlecht in der mobilen Phase löslich sind, bleiben länger an der stationären Phase hängen und werden nur langsam wandern. Stoffe die sich weniger stark anlagern und/oder gut in der mobilen Phase löslich sind wandern schnell.

Bezüglich Sichtbarmachen, Identifikation und Quantifizierung der aufgetrennten Stoffe siehe unter Papierchromatographie.

 

Vergleich Dünnschichtchromatographie / Papierchromatographie

Die Dünnschichtchromatographie zeigt:

  • bessere Auftrennung der Stoffe,
  • schnellere Auftrennung,
  • robuste stationäre Phase und robuster Träger (d.h., man ist in der Auswahl der Nachweisreagenzien ziemlich frei).
  • verschiedene stationäre Phasen verwendbar

Durch Weiterentwicklungen in der Dünnschichtchromatographie (siehe nächster Punkt) weist sie keine entscheidenden Nachteile mehr auf.

 

Breites Spektrum am Markt

Hier wurde die klassische Dünnschichtchromatographie beschrieben. Es gibt aber inzwischen zahlreiche Varianten, die alle unter dem Begriff Dünnschichtchromatographie laufen, sich aber von der ursprünglichen Form deutlich unterscheiden. 

  • Flexible Träger
    Das Adsorbens wird statt auf Glasplatten auf flexible Kunststofffolien aufgebracht. So muss man den Stoff nach der Trennung nicht abkratzen, um ihn zu gewinnen, sondern kann ihn wie bei der Papierchromatographie ausschneiden.
     
  • High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC)
    Durch Verwendung von Adsorbentien mit besonders kleiner Partikelgröße kann man Stoffe besser auftrennen, daher "high performance" (hohe Leistung). "Thin Layer Chromatography" ist Englisch für Dünnschichtchromatographie.
     
  • Reversed-Phase Thin Layer Chromatography (RP-TLC)
    Man kann auf die Adsorptionsmaterialien eine Schicht Kohlenstoffketten auftragen. Dadurch erhält man eine stationäre Phase, an die apolare Stoffe stark binden (hydrophobe Phase). Die mobile Phase kann dann polar (hydrophil) sein. Da das eine Umkehrung der klassischen Verhältnisse der Phasen ist, spricht man von "reversed phase"-Dünnschichtchromatographie oder seltener von Umkehr-Phasen Dünnschichtchromatographie.

 

Anwendungen der Dünnschichtchromatographie

Im medizinischen Routinelabor wird die Methode kaum noch eingesetzt. Manche Labors weisen damit Drogen oder Porphyrine im Harn nach (Porphyrine treten bei bestimmten Stoffwechselkrankheiten vermehrt auf). Spezialisierte Labors verwenden die Dünnschichtchromatographie auch zum Nachweis von seltenen Stoffwechseldefekten beim Neugeborenen.

 

Vergleich Dünnschichtchromatographie / Säulen-Chromatographie (HPLC, GC)

Die moderneren Verfahren wie HPLC und GC haben sich auf Grund ihrer deutlich höheren Leistungsfähigkeit und erweiterten Möglichkeiten durchgesetzt. Die Dünnschichtchromatographie wird in der Routineanalytik kaum noch verwendet. Sie hat aber auch Vorteile, die bei speziellen Anwendungen eine Rolle spielen können: Niedriger apparativer Aufwand, niedrige Kosten, einfache Durchführung, relativ robust gegenüber "verschmutzten" Proben. Mehrere Proben in einem Lauf analysierbar.


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Dünnschicht-Chromatographie, Papier-Chromatographie.
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Letzte Änderung 2004-10-26

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