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 TRANSFUSIONSMEDIZIN

Labormethoden der Transfusionsmedizin
DI(FH) Adelheid Weidinger, BMA

Für die großzügige Bereitstellung von Reagenzien und Verbrauchsmaterialien möchten wir der
Firma Diamed Diagnostic and Medical Products herzlich danken.

Zur Darstellung spezieller Fälle transfusionmedizinischer Laboruntersuchungen

Einleitung
 
Aufgaben des Labors in der Transfusionsmedizin:
  • Bestimmung von Merkmalen auf den roten Blutkörperchen
    Bevor man eine Bluttransfusion durchführen kann, muss man im Labor bestimmte Merkmale (z.B. die Blutgruppe) auf den roten Blutkörperchen des Blut-Spenders und des Blut-Empfängers bestimmen.
     
  • Bestimmung  von Antikörpern
    Außerdem muss man überprüfen, ob der Empfänger Antikörper gegen die roten Blutkörperchen des Spenders in seiner Blutflüssigkeit (Serum) aufweist. Nur wenn keine solchen Antikörper vorhanden sind, wird der Empfänger die Blutspende vertragen.

Für diese Aufgaben gibt es verschiedene Labormethoden, die nachfolgend beschrieben sind.
Ergebnisse spezieller Fälle transfusionsmedizinischer Laboruntersuchungen finden Sie im Abschnitt Fallstudien.

 
    

 

Agglutinationstests
 
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Einführung
  • Merkmale auf den roten Blutkörperchen - sogenannte Antigene -  werden mit Hilfe ihrer "Gegenstücke" - sogenannter Antikörper - bestimmt.
    Will man z.B. die Blutgruppenantigene bestimmen, gibt man zu den roten Blutkörperchen des Patienten Antikörper gegen das Blutgruppenantigen A und B dazu. Je nach der Blutgruppe werden sich die Antikörper gegen A oder gegen B, beide Antikörper oder gar keine an die roten Blutkörperchen binden.
  • Möchte man andererseits Antikörper gegen rote Blutkörperchen bestimmen, verwendet man wiederum bekannte Antigene.
    Beispiel: man will wissen ob ein Patient in der Blutflüssigkeit (Serum) einen bestimmten Antikörper hat. Man nimmt rote Blutkörperchen, die das passende Antigen an der Oberfläche aufweisen und vermischt diese mit dem Serum des Patienten. Ist der Antikörper im Serum vorhanden wird er sich an die roten Blutkörperchen binden.

In beiden Fällen gehen Antigene und Antikörper eine Verbindung ein = Antigen-Antikörper-Reaktion. Dabei kann man mit Hilfe des bekannten Reaktionspartners den unbekannten Reaktionspartner identifizieren.

Voraussetzung dafür ist aber, dass die Antigen-Antikörper-Reaktion sichtbar gemacht wird. Und am einfachsten wird die Reaktion dann erkennbar, wenn eine Verklumpung (Agglutination) eintritt:
 

Reagieren "große" Antikörper (sog. IgM-AK) mit roten Blutkörperchen, bilden sich Klumpen aus roten Blutkörperchen - eine "Agglutination" wird sichtbar.

"IgM-Antikörper" binden an roten Blutkörperchen und führen zu einer "Verklumpung"

Positive Reaktion von Antikörper und roten Blutkörperchen auf einer Glasplatte

Nicht immer ist es so einfach: Handelt es sich z.B. um IgG-AK, ist eine Bindung an rote Blutkörperchen nicht ohne weiteres sichtbar. Es tritt keine Verklumpung ein, da der IgG-AK zu klein ist (Rote Blutkörperchen stoßen einander ab. Sie kommen einander normalerweise nicht so nahe, dass IgG-Antikörper sie verbinden könnten).

"IgG"-Antikörper binden an rote Blutkörperchen, eine Verklumpung ist jedoch nicht möglich

Negative Reaktion von roten Blutkörperchen auf einer Glasplatte

Daher nutzt man diverse Hilfsmittel/Zusatzstoffe, um auch in solchen Fällen eine Agglutination auszulösen (Antiglobulin-Techniken, Supplementtechnik, Enzymtechnik).

Prinzip:
Vermischung einer Erythrozytenaufschwemmung (in physiologischer Kochsalzlösung) mit antikörperhältigen Seren. Es kommt zu einer Antigen-Antikörper-Reaktion (AAR) = Spezifische Bindung von Antigen (AG) und korrespondierendem Antikörper (AK) zu einem Antigen-Antikörper-Komplex.

Techniken:
Die Vermischung der Reaktionsteilnehmer kann im Röhrchen, auf Platte, Objektträger, in Näpfchen oder speziellen, Gel-gefüllten Mikroröhrchen (Gelzentrifugation) erfolgen.
Während früher die Röhrchen und Plattentechniken vorherrschten, ist heute die Gelzentrifugationstechnik am weitesten verbreitet.
 

1. Röhrchen

Rote Blutkörperchen und Serum werden in einem Röhrchen gemischt. Danach muss meist (je nach Anwendung) eine Inkubationsphase abgewartet werden. Dann wird das Röhrchen zentrifugiert. Die roten Blutkörperchen bilden danach einen Knopf am Boden des Röhrchens. Dieser Knopf wird jetzt vorsichtig aufgeschüttelt (=Resuspension):

Positive Reaktion von Antikörper und roten Blutkörperchen im Glasröhrchen Positive Reaktion
Beim Aufschütteln sieht man Klumpenbildung.
Negative Reaktion von roten Blutkörperchen im Glasröhrchen Negative Reaktion
Keine Klumpen erkennbar.

Vorteile:

  • empfindliche und sichere Methode
  • keine Eintrocknungserscheinungen

Nachteile:

  • Zentrifugationsschritt und evtl. Inkubationsschritt erforderlich, daher aufwändiger als Platte bzw. Objektträger
  • Falsch negative Ergebnisse durch zu kräftige Resuspension möglich

 

 

2. Glasplatte, Objektträger

Rote Blutkörperchen und Serum werden auf einer Glasplatte vermischt (durch Schwenken und/oder mit Hilfe von Stäbchen). Nach dem Mischen sieht man, ob die roten Blutkörperchen verklumpen (links) oder nicht (rechts).

Positive Reaktion von Antikörper und roten Blutkörperchen auf einer Glasplatte

Negative Reaktion von roten Blutkörperchen auf einer Glasplatte

Positive Reaktion

Negative Reaktion

Vorteil:

  • besonders geeignet für Eil- bzw. Notfälle.
    Eine Variante der Glasplattentechnik ist die Kartentechnik. Dabei verwendet man Karten auf denen bereits Testreagenzien (angetrocknet) vorhanden sind. Man braucht nur mehr Blut dazuzutropfen und zu verrühren. Anwendung im sog. "Bed-Side-Test" (letzte Blutgruppenüberprüfung vor Transfusion am Bett des Patienten).

Nachteile:

  • geringere Empfindlichkeit
     
    Eine Variante der Plattentechnik bietet eine Steigerung der Empfindlichkeit und beträchtliche Reagenzersparnis: die sog. Bioplates.
    Bioplates sind ca. Taschenbuch-große Kunststoffplatten mit über hundert durch, kreisförmige Vertiefungen voneinander abgegrenzten Arealen, auf die man rote Blutkörperchen und Serum aufbringen kann. Dabei wird nur sehr wenig Reagenz verbraucht.

    Positive Reaktion von Antikörper und roten Blutkörperchen auf "Bioplates"

    Negative Reaktion von roten Blutkörperchen auf "Bioplates"

    Positive Reaktion

    Negative Reaktion

  • Infektions- und Verletzungsgefahr durch evtl. Glasbruch

 

3. Tüpfelplatte

Rote Blutkörperchen und Serum werden auf speziellen Platten mit näpfchenartigen Vertiefungen vermischt.

Vorteil:

  • Empfindlicher als Glasplatte bzw. Objektträger

Nachteil:

  • Rasches Ablesen erforderlich - sonst können Eintrocknungserscheinungen fälschlich als Agglutination beurteilt werden

 

4. Gelzentrifugation

Prinzip:
Im Mittelpunkt der Geltechnik stehen kleine, mit Dextran-Gel befüllte Röhrchen. Am oberen Ende haben sie eine trichterförmige Öffnung. In dieser kann man rote Blutkörperchen und Serum mischen. Dann lässt man das Gemisch eine Zeit reagieren (Inkubationszeit). Anschließend wird das Gelröhrchen zentrifugiert. Verklumpte Blutkörperchen bleiben oben (positive Reaktion). Hat hingegen keine Antigen-Antikörper-Reaktion stattgefunden, dann gehen die einzelnen, nicht verklumpten Blutkörperchen durch das Gel durch und bilden unten einen Knopf (negative Reaktion).

Bei der Zentrifugation der Gelröhrchen werden agglutinierte Erythrozyten von den nicht agglutinierten Erythrozyten deutlich getrennt:
(Darstellung nach der Zentrifugation)

Positive Reaktion von Antikörper und roten Blutkörperchen in einer Gelkarte Schwach positive Reaktion von Antikörper und roten Blutkörperchen in einer Gelkarte Negative Reaktion von roten Blutkörperchen in einer Gelkarte
Positive Reaktion
Eine positive Reaktion ist als rote Linie auf dem Gel sichtbar.
Schwach pos. Reaktion
Bei schwach positiven Reaktionen sind die Agglutinate im Gel verteilt.
Negative Reaktion
Bei negativen Reaktionen sind die Erythrozyten am Boden der Mikroröhrchen als roter Knopf sichtbar.

Bei anderen Varianten der Gel-Technik sind im Gel bestimmte Antikörper gebunden. Erythrozyten, die das passende Antigen auf der Oberfläche tragen, bleiben bei der Zentrifugation im Gel hängen. Dies verwendet man z.B. zur Blutgruppenbestimmung (in den Gelröhrchen ist Anti-A, Anti-B usw.) und für den sog. Coombs-Test (bei diesem sind Antikörper gegen menschliche Antikörper im Gel. Näheres siehe unter Antiglobulin-Techniken).

Beispiele für Gelkarten-Anwendungen
In der Blutgruppen-Antigen-Bestimmung, beim Coombs Test und der Antikörpersuche
(dargestellt vor der Zentrifugation)

Pipettierschema für Blutgruppen- und Rhesuskarte

Für Blutgruppen- und Rhesusfaktorbestimmung werden die roten Blutkörperchen in einer speziellen Lösung aufgeschwemmt und in die Gel-Röhrchen pipettiert. Danach erfolgt die Zentrifugation.

Pipettierschema für den Direkten Coombstest (DCT)

Für die Bestimmung des DCT (Direkter Coombstest) werden die roten Blutkörperchen in einer speziellen Lösung aufgeschwemmt und in die Gel-Röhrchen pipettiert. Danach erfolgt die Zentrifugation.

Pipettierschema für den Indirekten Coombstest (ICT)

Für die Antikörpersuche werden Test-Blutkörperchen und Patientenserum pipettiert und anschließend inkubiert.
Wichtig ist das richtige Pipettieren (Luftblase zwischen Gel und Gemisch) da es sonst zur Inaktivierung der Antikörper kommen kann. Dies führt zu einer falsch negativen Reaktion

 

Beispiel verschiedener Gel-Arten
(üblicherweise sind mehrere Gel-Röhrchen zu sog. Gel-Karten zusammengefasst)

Neutral-Gel
  
Neutral-Gelkarte

 

Aufbau: Dextrankügelchen in Suspensionsmedium
Anwendung:
Serumgegenprobe, Antikörper-Suchtest bzw. -Differenzierung
Spezifisches Gel AB0-Rhesus

ABO-Karte

 

Aufbau: Dextrankügelchen + Spezifische Antikörper gegen Blutgruppenfaktoren
Anwendung: Blutgruppenbestimmung
Spezifisches Gel Rhesusuntergruppen

Rhesuskarte

 

Aufbau: Dextrankügelchen + spezifische Antikörper gegen Blutgruppenfaktoren
Anwendung: Rhesus- und Kellbestimmung
Liss/Coombs-Gel

Liss/Coombskarte

Aufbau: Dextrankügelchen + Coombs-Serum
Anwendung: Antikörper-Suchtest bzw. -Differenzierung, ICT u. DCT

 

Vorteile:

  • Keine falsch negativen Ergebnisse durch z.B. zu kräftige Resuspension
  • Erfordert nur geringes Probenvolumen (Neonatologie, Pädiatrie)
  • Minimaler Beschriftungsaufwand - daher rasches Arbeiten möglich
  • Sauberes Arbeiten durch Einmalartikel
  • Keine Waschvorgänge notwendig
  • Reaktion bleibt 2 Tage lang unverändert und klar beurteilbar
  • Gute Dokumentierbarkeit - durch spezielle Lesegeräte oder Fotokopie
  • Klares Reaktionsbild : positive, schwach positive und negative Reaktionen sind deutlich unterscheidbar, was eine sichere standardisierte Interpretation der Resultate gewährleistet

Nachteile:

  • Für Notfall-Blutgruppen nicht geeignet (10minütige Zentrifugation)
  • Spezialzentrifuge für Gelkarten notwendig
  • Hohes Müllaufkommen

 

5. Festphase (Capture, Solidscreen)

Prinzip:

  • AK-Suche

AG ist in einem Reaktionsgefäß (Näpfchen) an eine feste Unterlage gebunden. Serum wird zupipettiert. Befindet sich der AK im Serum, bindet er an das AG.

Anschließend werden Antihuman-IgG beladene Indikator- Erythrozyten zugegeben. Diese binden an den gesuchten AK. Es entsteht ein "Zellrasen" = positive Reaktion.

Findet sich der gesuchte AK nicht im Serum, sedimentieren die Indikatorzellen durch Zentrifugation zu Boden und bilden einen "Zellknopf" = negative Reaktion

  • AG-Suche

Spezifische Immunglobuline = Testseren sind an die Näpfchenwand gebunden. Zu testende rote Zellen werden zupipettiert.

Befindet sich das korrespondierende AG auf den Zellen, bindet es am Testserum. Es entsteht ein "Zellrasen" = positive Reaktion

Findet sich das gesuchte AG nicht auf den Erythrozyten, sedimentieren diese durch Zentrifugation zu Boden und bilden einen "Zellknopf" = negative Reaktion

 

Positive Reaktion in einem Festphasensystem Negative Reaktion in einem Festphasensystem
"Zellrasen" =
Positive Reaktion
"Zellknopf" =
Negative Reaktion

 

Vorteile:

  • Zur Bearbeitung von Großserien - Beschickung der Platten durch Pipettierautomaten. Ablesen durch automatische Lesegeräte

Nachteile:

  • hohe Kosten
  • erfasst nur IgG-Antikörper

 

 

Quantitativer Agglutinationstest
 
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Wie im letzten Abschnitt beschrieben, hilft der Agglutinationstest zu erkennen, ob bestimmte Antikörper im Serum vorhanden sind oder nicht. Meist genügt dieses Ergebnis. Manchmal ist es jedoch notwendig, auch die Menge (= Quantität) der vorhandenen Antikörper zu bestimmen. Dazu dient der quantitative Agglutinationstest. Man nennt ihn auch "Titerbestimmung".

 

Technik:
Ansatz von antikörperhältigem Serum in geometrischer Verdünnungsreihe gegen Erythrozytenaufschwemmung (in physiologischer Kochsalzlösung).

Der Nachweis der letzten deutlichen Agglutination entspricht der Titerstufe.

Anwendung:

  • Abschätzung der AK-Menge (z.B. Titerkontrollen im Verlauf der Schwangerschaft, nach Transfusionszwischenfall)
  • Dosistitration - liegt ein bestimmtes Allel in doppelter oder einfacher Dosis vor
  • Erkennung reproduzierbar abgeschwächter AG z. B. A3B
  • Identifizierung von z. B. Anti-I - Unterscheidung zwischen Auto- und Allo-AK

 

 

Antiglobulin-Techniken
 
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Antiglobulin-Techniken werden für verschiedene Zwecke eingesetzt. Gemeinsam ist ihnen, dass man überprüft, ob auf roten Blutkörperchen Antikörper sitzen, also ob die roten Blutkörperchen mit Antikörpern "beladen" sind. Das macht man, indem man Antikörper gegen diese Antikörper zusetzt. Sind die Blutkörperchen mit Antikörpern beladen, werden sie durch Zugabe des 2. Antikörpers verklumpt oder auf andere Weise nachweisbar.
(Da die Antikörper zu der Eiweißgruppe der Globuline gehören nennt man diese Methoden Antiglobulin-Techniken)
 

Rote Blutkörperchen mit Antikörpern beladen

Die roten Blutkörperchen sind mit Antikörpern beladen. Erkennen kann man das aber nicht, weil keine Verklumpung (Agglutination) eintritt.

Durch den grünen "Anti-Antikörper" verklumpen die Blutkörperchen Gibt man Antikörper gegen die blauen Antikörper dazu, werden die roten Blutkörperchen verbunden. Jetzt können sie verklumpen. Diese Reaktion kann man auch mit freiem Auge in einem Glasröhrchen erkennen.

Man wendet Antiglobulintechniken einerseits zum Nachweis von Antikörpern im Serum oder von Antigenen auf roten Blutkörperchen (viele sind nur mit Antiglobulin-Techniken nachweisbar). Außerdem hilft die Überprüfung einer Antikörperbeladung der roten Blutkörperchen eines Patienten, die Ursache einer Hämolyse (Erkrankung mit Zerstörung roter Blutkörperchen) abzuklären.

 

Prinzip:
Sind menschliche Erythrozyten (in vivo oder in vitro) mit Globulin (= Antikörper) beladen, werden sie durch AHG (= AntiHumanGlobulin)-seren agglutiniert.

Die AHG-Seren werden durch Immunisierung von Tieren (z.B. Kaninchen) mit menschlichen Globulinen gewonnen.

a) Direkter Antiglobulintest (DCT - Direkter Coombstest)

Zum Nachweis einer in-vivo-Beladung der Erythrozyten

Technik:
Ansatz von gewaschenen Patientenerythrozyten und AHG-Serum

Anwendung:

  • Untersuchung von Transfusionsreaktionen
  • Diagnose des Mhn (Morbus hämolyticus neonatorum)
  • Nachweis einer AIHA (AutoImmunHämolytischen Anämie)

 

b) Indirekter Antiglobulintest (ICT - Indirekter Coombstest)

Technik:
Zuerst wird antikörperhältiges Serum mit entsprechenden Testerythrozyten inkubiert und anschließend werden die Erythrozyten gewaschen.

Danach wird AHG-Serum zugegeben. Es erfolgt die Zentrifugation und das Ablesen der Reaktion.

Anwendung:

  • Nachweis und Identifizierung von Antikörpern
  • Kreuzprobe
  • Bestimmung von Erythrozytenantigenen, die mit anderen Methoden nicht nachweisbar sind

 

 

Supplementtechnik (früher Konglutinationstest)
 
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Wie im Abschnitt Agglutinationstest beschrieben, kann man mit bekannten Antikörpern gewisse Merkmale (Antigene) auf den roten Blutkörperchen nachweisen. Umgekehrt kann man mit roten Blutkörperchen, deren Merkmale man kennt, überprüfen, ob bestimmte Antikörper im Serum vorhanden sind oder nicht.
Im einfachsten Fall gibt man Serum und rote Blutkörperchen zusammen. Finden die Antikörper passende Antigene auf den roten Blutkörperchen, werden sie sich an diese binden und zur Verklumpung (Agglutination) bringen, was man leicht erkennen kann.
In vielen Fällen genügt es jedoch nicht, nur ein Gemisch aus "Antikörpern" und "Antigenen" herzustellen. Der Antikörper verbindet sich zwar mit dem roten Blutkörperchen, er ist aber zu klein, um eine zweite Zelle zu erreichen. Es kommt zu keiner Verklumpung.
Daher nutzt man verschiedenen Hilfsstoffe, wie z.B. Albumin, um dennoch eine Verklumpung zu erreichen. Dies nennt man Supplement-Technik.

IgG-Antikörper binden an rote Blutkörperchen, können diese aber  nicht zur Verklumpung bringen.

Als Hilfstoff wird dem Reaktionsansatz Albumin zugegeben

IgG-Antikörper verklumpen mit den roten Blutkörperchen

Die blauen Antikörper sind zu klein, sie können keine Verklumpung auslösen.
(Rote Blutkörperchen stoßen einander ab. Sie kommen einander normalerweise nicht so nahe, dass IgG-Antikörper sie verbinden könnten)

Zugabe des Supplements Albumin verringert die Abstoßung der roten Blutkörperchen. Jetzt können sie durch den Antikörper verklumpt werden.

 

Prinzip:
Entspricht dem des qualitativen Agglutinationstests.

Technik:
Durch Zugabe von Supplement (meist Albumin) wird das Zetapotential der Erythrozyten verringert. Dadurch wird die Abstoßung der Erythrozyten voneinander verringert und auch IgG-Antikörper können eine Agglutination auslösen. Dadurch können IgG-AK leichter identifiziert werden.

Wird heute selten angewendet, da weniger empfindlich als Antiglobulintest oder Enzymtechniken.


 

 

Enzymtechniken
 
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Wie im Abschnitt Agglutinationstest beschrieben, kann man mit bekannten Antikörpern gewisse Merkmale (Antigene) auf den roten Blutkörperchen nachweisen. Andererseits kann man mit roten Blutkörperchen, deren Merkmale man kennt, überprüfen ob bestimmte Antikörper im Serum vorhanden sind oder nicht.
Im einfachsten Fall gibt man Serum und rote Blutkörperchen zusammen. Finden die Antikörper passende Antigene auf den roten Blutkörperchen, werden sie sich an diese binden und zur Verklumpung (Agglutination) bringen, was man leicht erkennen kann.
In vielen Fällen genügt es jedoch nicht, nur ein Gemisch aus "Antikörpern" und "Antigenen" herzustellen. Der Antikörper verbindet sich zwar mit dem roten Blutkörperchen, er ist aber zu klein, um eine zweite Zelle zu erreichen. Es kommt zu keiner Verklumpung.
In diesen Fällen kann verschiedene Hilfsstoffe einsetzen, um eine sichtbare Reaktion zu bekommen. Bei der Enzymtechnik werden bestimmte Enzyme (Biokatalysatoren) eingesetzt, die die Oberfläche der roten Blutkörperchen verändern und eine Verklumpung erleichtern.

IgG-Antikörper binden an rote Blutkörperchen, können diese aber  nicht zur Verklumpung bringen.

Als Hilfstoff wird dem Reaktionsansatz Enzym zugegeben

IgG-Antikörper verklumpen mit den roten Blutkörperchen

Die blauen Antikörper sind zu klein, sie können keine Verklumpung auslösen.
(Rote Blutkörperchen stoßen einander ab. Sie kommen einander normalerweise nicht so nahe, dass IgG-Antikörper sie verbinden könnten)

Zugabe von Enzym (oder Vorbehandlung der roten Blutkörperchen) mit Enzym verringert die Abstoßung der roten Blutkörperchen. Jetzt können sie durch den Antikörper verklumpt werden.

 

Prinzip wie Supplementtechnik.

Statt Albumin werden aber Enzyme verwendet. Diese proteolytischen Enzyme wie Bromelin (aus Ananas), Papain (aus Carica papaya) oder Ficin (aus der Feige) reduzieren das Zetapotential der Erythrozyten durch Ladungsveränderung an der Zelloberfläche. Dadurch wird die Abstoßung der Erythrozyten voneinander verringert und auch IgG-Antikörper können eine Agglutination auslösen. Dadurch können IgG-AK leichter identifiziert werden.

Technik:

  • Einstufen-Enzymtest

Probandenserum, Testerythrozyten und Enzym werden gleichzeitig angesetzt, anschließend inkubiert und zentrifugiert

  • Zweistufen-Enzymtest

In einem ersten Schritt werden Testerythrozyten und Enzym inkubiert und erst anschließend wird Probandenserum zugesetzt

Vorteile:

  • Nachweis von inkompletten IgG-AK - diese können sich zwar an Erythrozyten anlagern, es kommt jedoch ohne Hilfsmittel zu keiner Agglutination
  • Empfindlicher als Supplementtechnik

Nachteile:

Durch Proteasewirkung kommt es zur Zerstörung bestimmter AK bzw. AG wie z. B. M, N, Fya+b,...

  • Mehr Unspezifitäten durch erhöhte Empfindlichkeit

Anwendung:
Besonders gut geeignet zum Nachweis von Rhesus- und Kälte-Antikörpern


  

 

Absorptionstechniken
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In der menschlichen Blutflüssigkeit befinden sich spezielle Eiweißstoffe (= Antikörper), von denen sich manche an rote Blutkörperchen binden können.

Diese Tatsache macht man sich bei der sog. "Absorptionstechnik" zu Nutze: Man fügt der menschlichen Blutflüssigkeit im Laborversuch bestimmte rote Blutkörperchen zu. Die zu den Blutkörperchen passenden Antikörper verbinden sich mit diesen zu Komplexen.

Beim Zentrifugieren sinken diese Komplexe zu Boden und man erhält eine Flüssigkeit, die frei von den gebundenden Antikörpern ist.

Absorption = Entfernung eines AK aus dem Serum

Technik:

Ansatz von antikörperhältigem Serum mit Erythrozyten, die das AG tragen, gegen das der AK gerichtet ist.

Es bildet sich ein AG-AK-Komplex. Durch Abzentrifugieren der Erythrozyten erhält man ein Serum, aus dem der AK, der gegen die Erythrozyten gerichtet war, entfernt ist (oder zumindest stark vermindert ist).

Anwendung:

  • Trennung von AK verschiedener Spezifität

  • Entfernung von Auto-AK um eventuell vorhandene Allo-AK nachzuweisen

  • Bestätigung einer AK-Spezifität


 

 

  Elutionstechniken (Antikörper-Absprengung)
 
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In der menschlichen Blutflüssigkeit befinden sich spezielle Eiweißstoffe (= Antikörper), die sich an bestimmte Merkmale der roten Blutkörperchen  (Antigene) binden können.

Diese Verbindung von Antikörper und Antigen nennt man auch Antigen-Antikörper-Komplex.

Liegen solche Komplexe vor, kann es notwendig sein, die Antikörper von den Antigenen zu trennen. Meist tut man dies, um zu erkennen, um welche Antikörper es sich handelt.

Dies geschieht unter Zuhilfenahme diverser Chemikalien oder einfach durch Temperaturveränderung.

Nach der Absprengung (= Elution) können die Antikörper mit diversen Methoden weiter untersucht werden (Agglutinationstest, Quantitativer Agglutinationstest, Supplementtechnik, Enzymtechnik, Antiglobulin-Technik,..)

Elution = Entfernung eines auf der Oberfläche von Erythrozyten adsorbierten AK. Die Adsorption des AK kann in vivo (z. B. bei Autoimmunreaktion) oder in vitro erfolgt sein.

Technik:

Die Absprengung des AK kann durch verschiedene Methoden erfolgen:

Hitze, Kälte, Säure, Ultraschall, Wärme, Aether, Chloroform,...

Das AK-Molekül darf bei der Elution nicht zerstört werden, seine AG-bindende Funktion muß erhalten bleiben! Man will es ja nachher noch identifzieren.

Anwendung:

  • Nachweis und Identifizierung von AK auf kindlichen Zellen bei Mhn

  • Nachweis und Identifizierung von AK bei hämolytischen Anämien oder Transfusionsreaktionen (positiver DCT !)

  • Entfernung von AK nach Absorption zur weiteren Identifizierung

  • Nachweis von schwachen AG an Erythrozyten


 

 

Lysintest
 
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In der menschlichen Blutflüssigkeit befinden sich spezielle Eiweißstoffe - sogenannte Antikörper. Fallweise treten Antikörper auf, die gegen rote Blutkörperchen gerichtet sind.
Bei einer Bluttransfusion kann es dann zu einer Reaktion zwischen diesen Antikörpern und den transfundierten roten Blutkörperchen kommen, das heißt, die Antikörper binden an die roten Blutkörperchen.
In vielen Fällen werden solche Antikörper-beladenen roten Blutkörperchen vor allem in der Milz langsam abgebaut.
In manchen Fällen kann es aber auch eine raschere Zerstörung der roten Blutkörperchen noch in den Blutgefäßen kommen. Man spricht dann von "intravaskulärer Hämolyse".

Diesem Prinzip folgend, kann man im Laborversuch die "Gefährlichkeit" von Antikörpern testen: Man gibt das antikörperhältige Serum und die roten Blutkörperchen zusammen und überprüft, ob eine Hämolyse eintritt.

 

Prinzip:
In Gegenwart von Komplement (in jedem frischen menschlichen Serum enthalten) kann anstelle der Agglutination eine Hämolyse auftreten.

Technik:
Der Ansatz von Erythrozytenaufschwemmung mit antikörperhältigem Serum erfolgt im Röhrchen. Die Hämolyse ist im Röhrchen gut erkennbar:

Achtung! Da keine Agglutinate zu sehen sind, besteht die Gefahr, das Ungeübte die Reaktion fälschlicherweise als "negativ" bezeichnen!

Im Röhrchen imponiert die Hämolyse lackfarben.

Achtung: Hämolyse nicht fälschlicherweise als negative Reaktion bewerten.

Im Vergleich zur Hämolyse imponiert eine negative Reaktion trüb:

Im Vergleich dazu eine "normale" negative Reaktion.

Negative Reaktion

 

Anwendung:

  • Zur Erkennung von Hämolysinen (= AK, die die Komplementkaskade aktivieren und zur Lyse von Erythrozyten führen können) wie z. B. Anti A, Anti B, Anti AB, Anti I, Anti i, Anti Lea+b, Anti Jka+b, Anti Tja, Anti Vel,...

  

 

Inhibitionstechnik
 
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Nicht nur auf den roten Blutkörperchen, auch in anderen Flüssigkeiten wie z.B. im Speichel findet man Blutgruppeneigenschaften. Will man diese erkennen, kann man sich der sogenannten "Inhibitionstechnik" bedienen.
Dabei gibt man Antikörper gegen ein Blutgruppenmerkmal (z.B. Anti-A) zu der Speichelprobe. Sind im Speichel Blutgruppenmerkmale der Gruppe A, wird sich der Anti-A Antikörper an diese binden. Ist er gebunden, ist er aber nicht mehr wirksam, er ist "inhibiert".
Setzt man jetzt in einem 2 Schritt Blutkörperchen der Gruppe A zu, wird keine Reaktion mehr eintreten. Führt man dies mit verschiedenen Antikörpern und Blutkörperchen durch, lässt sich die Blutgruppe im Speichel ermitteln.

Inhibitionstechnik ist eine spezielle Form der Absorptionstechnik.

Von Absorption spricht man, wenn die AG, die den AK absorbieren an Zellen gebunden sind, von Inhibition, wenn diese AG in einer Flüssigkeit (z. B. Speichel, Serum) gelöst vorliegen.

Technik:
Ansatz von z.B. Speichel mit antikörperhältigem Serum. Anschließend Zugabe von geeigneten Erythrozyten.
Ist das gesuchte AG im Speichel enthalten, wird der zugesetzte AK inhibiert und kann nicht mit den nachfolgend beigefügten Zellen agglutinieren
Ist das gesuchte AG nicht enthalten, kommt es zur Agglutination von AK und beigefügten Zellen.

Anwendung:

  • Bestimmung der ABH- und Lewis-Gruppensubstanzen im Speichel

  • Forensische Medizin


  

 

Molekularbiologische Methoden
 
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Molekularbiologische Methoden in der Transfusionsmedizin untersuchen vor allem die menschliche DNA (= Desoxyribonukleinsäure).
Als DNA bezeichnet man die Erbinformation-tragenden Ketten in den Chromosomen. Die Gesamtheit der Erbinformation nennt man Genom. Chromosomen sind fadenförmige Strukturen, die im Zellkern von bestimmten Zellen vorliegen.
Anwendungen: HLA-Typisierung (vor Transplantationen oder zur Abschätzung von Krankheits-Risiken), Vaterschaftstest, Täterermittlung in der Kriminalistik.

 

1. RFLP (Restrictions Fragment Length Polymorphismus)

Prinzip:
Restriktionsendonukleasen können doppelsträngige DNA bei bestimmten Nukleotidsequenzen (= Restriktionsstelle) "schneiden".

Diese Schnittstellen sind über die gesamte DNA eines Individuums zufällig verteilt. Durch mutationsbedingten Basenaustausch werden solche Schnittstellen zerstört, wodurch die Längenvariabilität der DNA-Fragmente verschiedener Menschen entsteht.

Technik:
Nach Behandlung der DNA mit Restriktionsendonukleasen können die DNA-Fragmente nach Größe getrennt werden. Anschließend werden diese auf Nitrozellulose geblottet und mit einer speziell markierten Gensonde inkubiert. Der Nachweis erfolgt durch Autoradiographie, Fluoreszenz, Histochemie oder andere Methoden.

Anwendung:

  • HLA-Typisierung
  • Paternität (Vaterschaftstest)
  • Forensische Medizin (Gerichtsmedizin)

 

2. PCR (Polymerase-Chain-Reaction)

= Primer mediierte spezifische Amplifikation (Vermehrung) kurzer DNA-Segmente (100 - 3000 Basen) mittels einer DNA-Polymerase

Prinzip:   siehe PCR-Technik

Anwendung:

  • HLA-Typisierung (vorwiegend Klasse II)
  • Identifizierung seltener Blutgruppen
  • Paternität
  • Forensische Medizin

 

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Letzte Änderung 2007-10-14

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