METHODE FITC-ANTIKÖRPER "lyse_stain_19"

Für Antikörper, die Antigene markieren, die im Übermaß im Serum vorkommen (kappa,lambda, IGM,...) und solche Antikörper, bei denen das nicht ausgeschlossen ist, muss das Blut vorher gewaschen werden. Wir fangen dann gleich mit der Lyse an. Da bei den meisten dieser Antikörper die Expression auf B-Zellen interessant ist, wird der CD14er im Antikörpergemisch durch den CD19er ersetzt.

1. Je Falcon Röhrchen 25 µl EDTA-Vollblut

2. NH4Cl-Lyse

   Zugabe von 2 ml Ammoniumchlorid-Lysereagenz (ohne Fixierungsmittel)

3. 8 Minuten Inkubation in der Dunkelheit bei Raumtemperatur

4. Zentrifugation 7 Minuten bei 300xG und 4°C, Überstand Absaugen

[Anmerkung: falls Sie NH4Cl-Lyse nicht gewohnt sind: Die Lysezeiten sollte man nicht übertreiben, auch die Zentrifugation empfiehlt sich bei 4°C und nicht zu heftig, da besonders die Granulozyten  aber auch die Monozyten relativ rasch zugrunde gehen und im FSC beträchtlich absinken können. Diese Angaben sind für Falcon Röhrchen und 2 ml Füllung. Wenn Sie - für andere Anwendungen - mit vollen 50ml Kulturröhrchen arbeiten, muss man länger zentrifugieren, sonst bleiben Zellen im Überstand]

5. 2 x Waschen mit PBS-BSA (0.5%), Zentrifugationen 7 Min, 300xG, 4°C

6. Resuspension in PBS-BSA (0.5%)

Das Resuspensionsvolumen soll möglichst klein sein, Ziel 25µl

7. + je 5 µl Fetales Kälberserum, Vortexen

8. Vorlegen der Antikörper (in neue Falcon-Röhrchen)

   Antikörpergemisch aus (je Röhrchen): 

3 µl CD45 PERCP BD
1.3 µl CD19 APC BD
1 µl HLA-DR PE BD
1 µl CD2 PE Immunotech
0.5 µl CD16 PE Immunotech
+ FITC Antiköper in der vom Hersteller empfohlenen Menge (für 25 µl Blut)
Vom Anti-Tamm-Horsfall-Protein Antiköper wurde 1µg eingesetzt.

9. Umpipettieren von je 25 µl Zellsuspension in die Falcon Röhrchen mit vorgelegten Antikörpern

10. Inkubation 30 Minuten bei 4°C

11. 2 x Waschen mit PBS-BSA (0.5%), Zentrifugationen 7 Min, 300xG, 4°C

12. Analyse an BD FACSCalibur, Standardeinstellungen für 4-Farbanalyse