METHODE FITC-ANTIKÖRPER "normal"

1. Vorlegen der Antikörper

   Antikörpergemisch aus (je Röhrchen): 

3 µl CD45 PERCP BD
1.3 µl CD14 APC BD
1 µl HLA-DR PE BD
1 µl CD2 PE Immunotech
0.5 µl CD16 PE Immunotech
+ FITC Antikörper in der vom Hersteller empfohlenen Menge (für 25 µl Blut)

2. Zugabe des Blutes

   + 25 µl EDTA-Vollblut, Vortexen

3. 20 Minuten Inkubation in der Dunkelheit bei Raumtemperatur

4. NH4Cl-Lyse

   Zugabe von 2 ml Ammoniumchlorid-Lysereagenz (ohne Fixierungsmittel)

5. 8 Minuten Inkubation in der Dunkelheit bei Raumtemperatur

6. Zentrifugation 7 Minuten bei 300xG und 4°C, Überstand Absaugen

[Anmerkung: falls Sie NH4Cl-Lyse nicht gewohnt sind: Die Lysezeiten sollte man nicht übertreiben, auch die Zentrifugation empfiehlt sich bei 4°C und nicht zu heftig, da besonders die Granulozyten  aber auch die Monozyten relativ rasch zugrunde gehen und im FSC beträchtlich absinken können. Diese Angaben sind für Falcon Röhrchen und 2 ml Füllung. Wenn Sie - für andere Anwendungen - mit vollen 50ml Kulturröhrchen arbeiten, muss man länger zentrifugieren, sonst bleiben Zellen im Überstand]

7. 2 x Waschen mit PBS-BSA (0.5%), Zentrifugationen 7 Min, 300xG, 4°C

8. Resuspension in PBS-BSA (0.5%)

9. Analyse an BD FACSCalibur, Standardeinstellungen für 4-Farbanalyse