METHODE PERCP-ANTIKÖRPER "ohne"

Wenn man z.B. den Antikörper CD45 PERCP austestet, sollte im Antikörpergemisch kein CD45 in anderer Farbe enthalten sein. Das gilt natürlich auf jeden Fall für gleiche Clones aber auch bei verschiedenen Clones, kann man nicht sicher sein, ob die beiden Antikörper einander nicht behindern. Genau genommen können sich natürlich auch verschiedene CD-Nummern behindern, aber dies alles auszutesten, würde zu großen Aufwand erfordern.

 

1. Vorlegen der Antikörper

   Antikörpergemisch aus (je Röhrchen): 

3 µl CD45 FITC BD weggelassen für Röhrchen CD45 PERCP
1.3 µl CD14 APC BD
1 µl HLA-DR PE BD
1 µl CD2 PE Immunotech
0.5 µl CD16 PE Immunotech
+ PERCP Antikörper in der vom Hersteller empfohlenen Menge (für 25 µl Blut)

2. Zugabe des Blutes

   + 25 µl EDTA-Vollblut, Vortexen

3. 20 Minuten Inkubation in der Dunkelheit bei Raumtemperatur

4. NH4Cl-Lyse

   Zugabe von 2 ml Ammoniumchlorid-Lysereagenz (ohne Fixierungsmittel)

5. 8 Minuten Inkubation in der Dunkelheit bei Raumtemperatur

6. Zentrifugation 7 Minuten bei 300xG und 4°C, Überstand Absaugen

[Anmerkung: falls Sie NH4Cl-Lyse nicht gewohnt sind: Die Lysezeiten sollte man nicht übertreiben, auch die Zentrifugation empfiehlt sich bei 4°C und nicht zu heftig, da besonders die Granulozyten  aber auch die Monozyten relativ rasch zugrunde gehen und im FSC beträchtlich absinken können. Diese Angaben sind für Falcon Röhrchen und 2 ml Füllung. Wenn Sie - für andere Anwendungen - mit vollen 50ml Kulturröhrchen arbeiten, muss man länger zentrifugieren, sonst bleiben Zellen im Überstand]

7. 2 x Waschen mit PBS-BSA (0.5%), Zentrifugationen 7 Min, 300xG, 4°C

8. Resuspension in PBS-BSA (0.5%)

9. Analyse an BD FACSCalibur, Standardeinstellungen für 4-Farbanalyse